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과학에서 어떤 물질이 있다는 것을 증명하는 것에 비해 그 물질이 없다는 것을 증명하는 일은 몇 십 배는 더 어려운 일이다. 인간 유전자의 암호가 밝혀지면서 특정 유전자의 작용, 특히 질병과의 관계에 관한 연구는 급속도로 빠르게 이루어 지고 있다. 이 분야에 상당한 기여를 하고 있는 것이 RNA interference(RNAi) 기술이다. 왜냐하면 거의 모든 organism에서 간단히 특정 gene을 switch off함으로서 질병에서 그 특정 gene의 역할을 규명 할 수 있기 때문이다. 발견 몇 십 년 전에 기존의 꽃보다 더욱 진한 진홍빛의 petunia 꽃을 만드는 연구가 있었는데 pigment-producing gene을 petunia에 삽입하는 기술을 이용하였다. 그런데 놀랍게도 반대로 흰색이나 색깔이 섞인 결과를 가져 왔다. 그들은 이 현상을 co-suppression이라 불렀고 이 후 비슷한 현상이 fungus와 nematode (Caenorhabditis elegans 꼬마선충)에서도 발견되었다. par-1 gene의 작용을 연구하기 위해 antisense 기술을 활용한 연구에서 유전자의 발현 억제 현상을 확인 하였다. 그런데 antisense 뿐만 아니라 대조 군으로 사용한 sense strand도 비슷한 결과를 보였다. 이 후 sense 와 antisense RNA (double-stranded RNA mixture)를 같이 사용한 결과 더욱 효과적인 gene silencing 현상을 나타냄을 확인하고 이 효과를 RNA interference 라고 하였다. RNAi는 원시적인 생명체, 특히 식물에서 RNA바이러스나 repetitive sequences, 혹은 transposon 같은 이동 성질을 가진 유전자들의 공격을 받게 될 때 이 호스트의 유전체를 외부 공격 물로부터 보호하는 원시적인 방어 기능이라고 생각 된다. 이 발견에서 시작된 연구는 이러한 mechanism이 mammals에서도 존재한다는 것을 알게 했고 질병에서 유전자의 기능을 이해하거나 특정 유전자의 작용을 확인하기 위한 방법으로 사용되고 있으며 나아가 암, AIDS, 기타 질병의 치료제로 사용하기 위한 연구로까지 진행되고 있다. 작용 기작 (Dicing and silencing) RNAi 에 대한 정확한 작용 기작은 아직도 완전히 밝혀지지 않았다. 다만 gene-silencing 효과가 transcription 이후 나타난다는 것이다. 왜냐하면 dsRNA가 introns를 target으로 만들어지기 때문이다. 따라서 RNAi를 post-transcriptional gene silencing (PTGS)로 설명 하고 있다. RNAi의 기본 과정은 dsRNA가 Dicer라고 하는 enzyme에 의해 작은 길이로 잘라 지는 것에 기인 한다. Dicer는 dsRNA를 21-23 nucleotides길이의 작은 RNA로 자르는데 이 작은 RNA를 경계가 모호하긴 하나 microRNAs (miRNAs)와 small interfering RNAs (siRNAs)로 구분하고 있다. RNAi의 주요 요소로 여겨지는 siRNA는 RNA-induced silencing complex (RISC)라 불리는 protein group으로 이동, siRNA의 antisense strand가 상보적인 mRNA를 degradation시킴으로써 gene silencing의 결과를 가져 온다. RNAi는 siRNA 와 mRNA 사이의 염기 서열 특이적 상호 작용에 기인 하기 때문에 거의 모든 gene을 특이적으로 silencing 할 수 있는 것으로 알려졌다. 따라서 화학적으로 합성한 siRNA도 mammalian cells에서 gene silencing을 가져올 수 있다. 즉, cell에 도입된 후 short hairpin RNAs (shRNAs)라 불리는 dsRNA hairpins를 형성하여 RNAi 효과를 유도한다고 한다. 실험실 수준에서의 RNAi를 이용한gene silencing은 매우 빠르고 편리한 방법이다. 특히 C. elegans에서 많은 발전이 있었는데 dsRNA를 발현하는 bacteria를 직접적으로 feeding하거나 심지어는 dsRNA를 적시는 방법으로도 gene silencing 효과가 나타난다고 한다. Genome sequencing project 이후 이 RNAi 를 이용한 gene silencing방법은 엄청난 수의 project에서 이용되고 있다. 치료제로서의 가능성 및 전망 질병과 관련된 유전자를 특이적이며 효과적으로 저해하기 위해 유전자의 DNA 서열을 확인하고 dsRNA를 design 하는 것은 monoclonal antibody를 만드는 것과 유사하다. 그러나 치료제로 개발하는 것은 결코 순탄하지만은 않다. 이유는 dsRNA는 보통 약 30nucleotides의 길이로 design 하는데 이것이 non-sequence-specific하게 interferon의 반응을 유도하는 문제가 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고 이 연구 개발은 많은 여러 방법으로 진행 중이다. 즉, siRNA를 직접 cell에 도입하거나 sense와 antisense siRNA를 모두 발현 할 수 있는 construct를 만들어 cell내에서 double-stranded siRNA를 형성 할 수 있게 하고 있다. 또는 viral vectors를 활용하기도 한다. 이런 RNAi에 기초한 치료제 개발은 HIV, Hepatitis, Cancer등의 분야에서 급진전하고 있다. RNAi의 여러 가지들이 아직도 미해결된 상태이지만 한가지 확실한 것은 DNA와 RNA, proteins이 어떻게 조절되고 작용하는지를 연구하는 데 혁신적인 방법을 제공하고 있다는 사실이다. 따라서 큰 제약 회사는 target validation tool로써 RNAi를 사용하고 작은 회사들은 효율적인 RNAi 방법을 찾거나 치료제로서의 가능성을 찾고 있다. 몇몇 회사들이 낙관하길 2-3년 안에 RNAi를 기초로 한 첫 번째 치료제가 임상 실험에 쓰일 수 있다고 보고 있다. 표1) Critical Factors for RNA Interference •Delivery – efficient (close to 100%) to any cell type •Stable, Long Term siRNA expression •Silencing Efficiency – siRNA design & validation •Specificity – non-specific response, toxicity, non-target knockdown •High Throughput siRNA screening – cost effective, rapid, user-friendly •Functional Assay – cover many disease-related studies 그림1) RNAi는 cell이 long double-stranded RNA (dsRNA)를 만날 때 개시된다. 이 dsRNA는 도입 유전자나 virus, rogue genetic elemente등으로부터 만들어 진다. 긴 dsRNA는 Dicer라는 enzyme에 의해 siRNA로 잘리고 RNA-induced silencing complex (RISC)가 siRNA의 strands를 구분하여 sense strand (blue)는 파괴되고 antisense strand (yellow)는 target gene을 silencing하는데 사용되는데 organism에 따라 다른 방향을 취한다. Fruitflies 나 mammals 에서는 antisense strand가 직접RISC와 합류하여 상보적인 target mRNA (green)를 깨트린다. SiRNA가 없는 경우는 RISC가 염기 서열 특이적으로 mRNA에 binding하는 기능이 없고 antisense strand에 결합함으로 활성화 된 RISC가 mRNA의 degradation에 참여하여 protein을 만들지 못하게 함으로써 효과적인 gene silencing을 가져 온다. Worms 이나 plants에서는 siRNA의 antisense strand가 증폭 과정에 사용되고 RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) enzyme에 결합한 antisense strand가 상보적인 mRNA (green)와 쌍을 이루어 긴 dsRNA를 합성하는 시작점으로 작용한다. 그런 다음 Dicer에 의해 같은 mRNA내에 다른 염기 서열 특이적인 새로운 siRNA (red)이 만들어 지고 다시 target mRNA가 파괴된다. (참고, Nature 2004, 430: 161-164).