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I. 서 론 Mass spectrometry는 GC-MS에 의한 유기 화합물의 정성, 정량분석에서부터 MALDI-TOF/MS에 의한 단백질의 분석까지 생물화학분야의 다양한 구조적 문제의 해결에 큰 기여를 하고 있다. 특히 최근 API (Atomospheric pressure ionization) 방법인 electrospray 및 APCI는 최근에 크게 각광받는 방법으로 자리잡게 되었다. 이에 따라 신약개발에 있어서 구조분석 및 정량분석을 담당하는 mass spectrometry의 역할도 마찬가지로 바뀌게 되었다. 본고에서는 신약개발의 새로운 방향으로 자리잡은 mass spectrometry의 high throughput processing을 조명하고자 하며, 이중 특히 각 개발과정에서의 mass spectrometry의 역할을 자세히 조명해보기 위해, 신약개발과정을 크게 protein chemistry, medicinal chemistry, 그리고 drug metabolism/drug pharmacokinetics으로 3가지 부분으로 나누어 설명을 하려고 한다. 신약개발과정에서 처음해야하는 일은 개발대상이 되는 질병을 선정하는 일이다. 일단 대상 질병이 확정되면, 각 질병에 관여하는 protein의 형질을 파악하고, 그 다음에 재조합 DNA technology를 사용하여 저분자 물질들의 작용 target이 될 수 있는 재조합 단백질을 만들게 된다. 이중 이들 단백질의 일차구조와 posttranslational modifications은 electrospray나 nanoelectrospray 뿐만 아니라 MALDI-TOF/MS 등에 의해서 동정된다. 일단 target protein이 확인되고나면, medicinal chemist들은 이 protein의 agonist나 antagonist가 될 수 있는 저분자 물질들을 합성하게되고, 그로부터 “선도물질”을 발견하고 난 후에는 구조 활성 상관 관계를 이용하여 이들의 생리활성을 최적화하게 된다 최근 combinatorial chemistry의 출현은 신약개발과정중 유기합성분야의 처리량을 크게 증가시켰다. 여기에, open-access mass spectrometer는 많은 시료를 짧은 시간에 처리하는데 크게 이용되고 있다. 생리활성을 최적화하고 난 후에는, 최적화된 화합물들의 bioavailability와 half-life 등 약물학적인 파라미터들을 LC-MS/MS에 의해 결정한다. 민약 biological half-life가 너무 짧다면, 그 물질의 구조중 metabolic instability 에 관여하는 부분의 구조정보를 주로 LC-MS/MS를 이용하여 결정, 확인하고, 이를 다시 합성팀에서 이 drug의 불안정성를 최소화하는 방향으로 약물의 구조를 변화시킨다. 최근 대부분의 굴지의 제약회사들은 보다 빨리 신약을 개발해야한다는 압력을 받아오고 있는데, mass spectrometry는 이와 같은 신약개발에서 speed를 높이는데도 크게 기여를 하고 있다. 더우기, 최근의 mass spectrometer에 의한 신속하고 높은 감도의 분석은 약물을 보다 신속하게 시장에 진출하게 함으로써 그 기기경비를 차감하고도 남을 정도이다. 특히 생체시료중에서 약물 또는 그 대사체를 분석하는 분야에서 더욱 효과적이기 때문에, 이로 인해 LC-MS/MS가 고가의 기기임에도 불구하고 LC-UV나 LC-fluorescence를 대체하고 있으며, 대부분의 굴지의 제약회사들이 최소한 수십대의 triple quadrupole mass spectrometer를 가지고 있다. II. 단백질의 동정에 응용되는 질량분석기술 Electrospray 및 MALDI mass spectrometer는 기기회사의 전폭적인 기기개발에 힘입어 단백질 화학 연구에 수많은 논문들이 나오고 있고,증가하고 있는 추세이다. 현재 많은 연구실에서 단순히 단백질의 분자량 정보를 확인하는 것 뿐만이니라 저분자물질과 단백질간의 결합부위 및 특정 단백질의 glycosylation pattern 정도 까지도 가능하다. 만약 분석하고자 하는 단백질이 미지의 단백질인 경우 주 목적은 amino terminal 기 또는 cloning을 위한 internal sequence 또는 mass mapping이나 분자량 정보에 의한 단백질의 단순한 확인, 또는 아미노산 sequence중 amino acid의 combination의 구성확인 등이 주 관심사이다. 시료의 량도 이경우에는 아주 한정적이어서, 수 picomoles단백질로 정보를 최대한 얻기위해서는 각 연구계획마다 적절한 tool을 사용하는 것이 아주 중요하다. 시료 조제 및 분리정제 기술이 어떠한 경우에는 mass spectrometric 부분보다 더욱 중요하며, mass spectrometry는 극소량의 시료로부터 최대한의 정보를 얻기위해 in-gel digestion이나 amino acid sequencing 과 같은 방법과 잘 연계되어야만 한다. II-1. MALDI-MS로부터 신속한 미지의 단백질 정보 구조 결정 MALDI-MS는 단백질을 동정하는 데 여러 가지 장점을 가지고 있다. 특히 분자량 측정에 있어 빠르고, 간편하고, 고감도의 데이터를 구할 수있으며, 샘플이 어느정도 불순물을 함유하고 있어도 별 무리가 없다. 필요한 시료량으로는 보통 0.1-1 mg/ml의 농도로 1-3 ml정도면 충분하다. 일반적으로 MALDI-MS는 생체시료중 소량 존재하는 미지 단백질의 정확한 분자량을 확인하는데 아주 유용하며, 또한 단백질이 posttranslationally modification이 되었는지 여부를 대략 확인하는데에도 아주 유용하다. 마찬가지로 이 방법은 재조합 단백질을 분석하는데에도 이용될수 있다. 단백질 그 자체의 분자량 측정뿐만 아니라, 단백질을 가수분해한 후 얻어진 peptide들을 Edman sequencing하기 전에 스크리닝하는데에도 MALDI-MS는 유용하다. 또 MALDI-MS에 의한 digested peptide의 screening은 가수분해된 peptide의 길이가 어느정도인지 등에 대한 정보를 제공해 줄수도 있다. MALDI-MS를 이용한 digest의 screening은 그 관심있는 분획에 있는 peptide의 대략적인 길이 정보를 제공할 뿐만 아니라 하나 이상의 peptide가 존재하는 지에 대한 정보도 제공한다 MALDI-MS fingerprinting data는 단백질의 database 검색을 위한 정보도 제공한다. 예를 들면, 단백질 분자량정보와 아미노산 분석 정보를 합하면 어느 정도는 미지의 단백질을 검색하는데 도움이 된다. 단백질 가수분해산물의 MALDI-MS 역시 database 검색을 위해, 가수분해된 단백질의 fingerprint를 제공하며, 단백질 가수분해물을 직접 MALDI-MS로 분석하는 것은 그 반응의 완결여부를 확인하는데 이용되기도 하다. 이 방법은 보통의 HPLC방법보다 훨씬 빠르고 적은 양이 소요된다. II-2. 재조합 단백질 (recombinant proteins) 재조합 단백질을 발현시킨후, 동정할 때는 미지의 시료의 단백질 경우와는 좀 다른 경우이다. 비록 같은 기법을 많이 사용하나, 시료량이 충분하기 때문에 얻고자 하는 정보를 가급적 많이 얻을 수 있기 때문이다. 하지만 이 재조합 단백질이 drug target을 위한 연구용으로 발현시킬 것인지, 아니면 엄격한 품질관리에 의해 생산할 치료제로서의 재조합 단백질인지에 따라 우선순위가 결정된다. 분석조건은 재조합단백질의 종류에 따라 다양하다. 각 경우에 있어서 아미노산 배열은 확인가능하며, 따라서 amino- 또는 carboxyl- terminal sequences가 무엇인지, 가수분해되는 주요 위치는 어디인지, 분자량은 얼마인지 등을 확인할 수 있다. 첫 번째 선결조건은 이러한 파라미터에 맞게 적절히 단백질이 발현되었나를 결정하는 일이다. 이를 위해 electrospray mass spectrometry에 capillary column을 연결하여 빠른 LC/MS를 통한 purity check가 첫 번째 step에서 필요하다. 분자량 측정으로서 반응의 완결여부를 확인할수 있고, mutation과, posttranslational modification등이 일어났는지 확인 가능하다. 특별한 잘못이 없다면 LC/MS 및 amino-terminal sequencing 분석만으로도 가능하다. 하지만, LC/MS 분석에 의해 mutation이 일어났거나, 잘못 제조되었거나, posttranslocation이 일어난 것이 확인되면, 해당 단백질을 가수분해한후 LC/MS로 mapping해보거나, peptides들을 MS/MS로 sequencing하는 두 번째 과정이 반드시 필요하며, 대부분의 재조합 단백질들은 이러한 과정을 거치게 된다. 종종 단백질이 phosphorylated되거나 glycosylated될때, 이런 것들이 해당 단백질의 중요한 기능과 연관이 있다면, 이들의 구조 정보를 밝히는 것 또한 중요한 작업이 된다. 비슷한 경우로서, target protein의 3차원입체구조를 연구할 때는 disulfide binding의 위치를 결정하는 것도 중요한 일이다. LC와 electrospray/MS를 연결할 수 있다는 장점 때문에, LC/MS는 이 분석을 위한 최적의 기기로 자리잡고 있다. II-3. Nanoelectrospray Ionization Mass Spectrometry Nanoelectrospray ionization mass spectrometry (nanoES)는 최근에 picomole이하의 단백질 시료를 동정하는데 소개된 기법이다 단백질을 먼저 적절한 효소에 의해 가수분해를 하고, 그 분해산물 1-2 ul정도를 분당 nanoliter단위로 metalic coating된 capillary column을 통하여 흘려준다. 이렇게 낮은 유속으로 흘려주면 1uL의 시료에 대해 분석시간을 1시간까지 늘릴수 있다. 이렇게 함으로써, 각각의 peptide들의 collision-induced dissociation (CID)조건을 최적화하는데 용이할 뿐만 아니라 가수분해산물로부터 각 peptide들의 MS/MS fragmentation 및 sequencing하는데에도 용이하다. 이전에 언급하였듯이, database검색 알고리듬에 의해, 각각 peptide들의 fragmentation spectra들로부터 (단일 스펙트럼의 2-3 잔기의 sequence을 비교함으로써 구할수 있음)단백질을 쉽게 검색해 낼수 있다. 이 방법은 비교적 에러가 없으며, 어느정도의 posttranslational modification이 일어나더라도 해당 단백질을 확인할 수 있다. database에 있는 단백질을 검색하기에 용이한 것외에도, nanoES는 cloning을 위한 새로운 단백질의 sequencing정보를 얻는데에도 사용된다. NanoES는 시료의 양이 한정되어있거나, capillary LC/MS로도 감도가 낮을경우에 가장 유용하다. 하지만, capillary LC/MS로 충분히 행할수 있을 정도의 감도라도, nanoES는 online separation이 가지고 있는 시간제약을 받지않고 여러 가지 mass spectrometric experiment를 행할 수 있게 해준다. NanoES는 특별히 1) 단백질의 초기 발현과 정제과정을 확인하는데 유용하고, 2) N-terminal protein sequence를 함유한 fusion protein (glutathione S-transferase (GST)) 과 N-terminally blocked protein들을 확인하는데 유용하고 3) 단백질의 posttranslational modifications이나 sequence error를 확인하는데도 좋다. nanoES의 protein 동정을 위한 또다른 유용한 기법은 백그라운드 시그널로 인해 MS mode에서는 관측될수 없는 analytes를 precursor ion scanning을 사용하는 것이다 [6]. precursor ion scanning은 tandem mass spectrometric experiment의 선택적인 기법으로, 특별한 fragment ion으로부터 precursor ion을 구하는 방법이다. High chemical background를 극복하는 데 유용한 예 이외에도, nanoES를 이용한 precursor ion scanning은 phospholylation 이나 glycosylation과 같은 posttranslational modification된 peptide를 확인하는데 유용하다. nanoES는 신약개발분야 특히 단백질 동정과 같은 분야에서 계속 발전적인 위치를 차지하고 있다. 아마도 nanoES의 가장 대표적인 예는 proteomics분야의 proteome mapping이며 genomic data와도 서로 상관관계를 가지고 있다. NanoES는 또한 combinatorial chemistry분야에서도 각 single beads로부터 유리되어 나오는 화합물을 고감도로 검출할 수 있기 때문에 각광을 받을 것으로 기대된다. III. 유기 합성분야에서의 질량분석 기술 신약개발 분야에 있어서 신약후보물질의 구조를 밝히고 확인하는 분야는 아주 빠른 속도로 진행되어왔다. 특히 combinatorial chemistry에서 기기자동화와 가장 잘 어울리는 기기가 바로 mass spectrometer이다. 과거에는 유기화학자들이 주로 정제된 최종산물 또는 중간체 시료 등을 제출하여 질량분석 측정을 의뢰하고, 분석화학자들은 다양한 방법 (electron impact (EI), fast atom bombadment (FAB), electrospray (ESI), etc)을 사용하여 이들을 분석, 해석한 다음 2-3일 후에 다시 유기화학자에게 반송되었다. 하지만, 보다 빠른 신약개발에 있어서 새로운 변화는 아래의 이유로 인해 위의 방법이 더 이상 의미를 가지기 힘들게 되었다. 제약산업에서 신약개발사업이 경쟁력을 가질려면 보다 많은 신약 후보물질이 보다 짧은 시간안에 창출되어야 한다. 특히 combintorial chemmistry는 빠른 turn-around time 뿐만 아니라, 보다 많은 시료처리를 요구하고 있기에, 비록 기존의 방법으로 어느정도 요구사항을 충족시킬수 있더라도, high throughput을 위해서는 새로운 방법이 절실히 요구되고 있다. 보다 새로운 solid-phase synthesis 및 multicomponent synthesis method는 새로운시료 전처리 및 질량분석기술을 요구하고 있으며, 이러한 경향은 해가 거듭될수록 더욱 심화될 전망이다. 이를 충족시키기 위해서, 실험실에서 시료 처리량을 증가시키기 위한 여러 가지 방법들이 시도되었다. 이러한 새로운 시도는 automation과 open-access mass spectrometry등을 통해, 전통 유기화학자 뿐만 아니라 combinatorial chemist에게 까지 영향을 미치게 되었다. III-1. Open-Access Mass Spectrometry 유기합성에 있어서 Mass Spectrometry는 미지의 구조 분석 또는 합성된 기지 물질을 확인하는데 사용되어왔다. 일반적으로 이런 목적으로는 molecular ion과 특징적인 fragment ions들이 주로 사용되어왔다. 아울러 다른 분석 데이터 와 함께 구조분석에 이용되기도 하였다. 구조를 해석하기위해 필요한 형식적인 자료로 IR, MS, NMR 등이 예상구조와 잘 일치하여야 한다. 그러나, 최종 산물 이전의 중간체인 경우, 반응산물의 존재여부와 그 산물이 얼마나 순수한지가 주요 관건이다. 이때는 반응의 완결여부나 순도를 떠나서 반응 생성물의 존재 여부를 확인하는 것이 중요하며 이를 위해서는 speedy한 분석이 필수적이다. 반응 결과를 빨리확인할수록, 보다 효과적이고 생산적이게 된다. 이러한 정보는 다른 방법 즉, NMR 또한 성공적으로 이용되고 있지만, 간혹 스펙트럼이 복잡하거나 특히 mixture인 경우에 해석하기 애매할 수 있다. mass spectrometry는 수분내에 혼합물 상태에서 정확한 분자량 정보를 제공해주고, 아울러 automation이 용이하다. 이런 장점 때문에, chemist들은 시료의 수가 한계를 넘어설 때, 빠른 결과를 위해 mass spectrometry를 이용해서 반응을 확인하려는 경향이 커졌다. 분석은 보통 chromatographic separation을 필요로 하지 않는데, 그 이유는 보통 요구되는 것은 "반응 생성물이 존재하는지" 여부를 확인하는 것이기 때문이다. 따라서, flow injection을 사용할 수 있다. 자동화 시스템을 위한 ionization method를 선택하는 것은 분석 대상 시료의 종류에 따라 다르다. 앞서 언급했듯이, HPLC autosampler와 함께 flow injection 방법을 사용하는 것이 쉽게 자동화될 수 있고, 시료량을 빠른 속도로 처리하는 데 용이하다. 비록 thermospray (TSP) 가 API instrument들이 널리 보급되기전에 사용된 적이 있으나, 현재는 APCI나 electrospray (ESI)같은 atomosphere-pressure ionization이 주로 이용되고 있다. APCI 및 ESI 둘 다 서로 상호보완적이다. heavy halogenated nucloeside나 highly aromatic compounds 등과 같은 종류의 화합물은 APCI에서는 좋은 결과를 보이나 ESI에서는 아주 약한 response를 보이기도 한다. 하지만, peptides나 tertiary-butyl oxocarbonyl (t-BOC) 치환된 amine이나 amides등과 aliphatic amine등은 반대의 결과를 보인다. 두가지 방법 다 널리 사용되고 있으나, 두가지 방법에서도 이온화되지 않는 화합물도 있눈데, 분자량이 작거나, protonation 부위가 없을 경우이다. 이런 시료들은 particle beam (PB) ionization이 유용한 것으로 알려져 있다. 빠른 turn-around time은 chemist들의 생산성과 유효성을 높이는 데 필수적이다. 반응의 과정을 monitoring 할 필요가 있을 때 이러한 빠른 turn-around time은 필요하다. 많은 경우에 있어서 출발물질과 반응생성물 모두 open-access system (APCI 나 ESI) 에서 pseudo-molecular ions을 관찰할수 있다. 대부분의 경우에서, 반응생성물의 피크는 점점 증가할 것이고, 출발물질은 점점 감소하여 종국에는 사라질 것이다. 물론 중요한 것은 mass spectrum에서 상대적인 peak 크기가 그 성분들의 상대적인 concentration을 나타내지는 않는다는 것이다. 하지만, 일정한 시간동안 반응을 monitoring한다면 상대적인 peak intensities는 반드시 변할 것이며 따라서 반응이 여전히 진행되고 있다는 것을 나타낼수 있다. 대부분의 경우, 반응은 steady-state에 이를때까지 관측한거나 (즉, 생성물과 출발물질의 ratio가 더 이상 변하지 않을 때까지), 또는 원하지 않는 by-product가 생성되기 전까지 체크한다. 반응에 따라, monitoring은 반시간내로 끝내거나, 여러시간까지 행하게 된다. 따라서, turn-around time을 20-30분으로 증가시키면 대부분의 경우 반응을 monitoring하기 불가능하다. III-2. 조합 화학(Combinatorial chemistry)과 mass spectrometry Combinatorial chemistry는 target enzymes에 대해 빠른 속도로 많은 화합물을 테스트하기 위해 도입된 개념이다. 최종목적은 해당 enzyme target에 대해 활성을 가지는 화합물, 즉 “hit”된 화합물을 발견해내는 것이다. 이들 화합물들은 차후에 더욱 개발되고 정제되어 선도물질 (leads)로 된다. 이로부터 "선도물질"은 보다 더 개발, 정제되어서 특정질환에 약효를 가지는 신약으로서 필요한 과정을 거치게 된다. 'hit' 단계에서는 보통 수만가지의 화합물들이 라이브러리에서 microgram이나 milligram 양으로 합성된다음, 생리활성을 검색하게되며, "leads" 단계에서는 수백 또는 수천개의 화합물들이 밀리그램 또는 그램단위로 합성된다. 이러한 화합물들을 만드는 방법은 다양하며, "hits" 단계나 "leads"단계를 위해 여러 가지 방법들이 도입되고 있다. 이들 화합물을 용액에서나, solid polymer support에서 합성되도록 하는 자동화된 기기들이 많이 개발되었다. solution-produced compound인 경우에는 앞서 언급한 open-access 방법처럼 분석되어질수 있으나, biological assay를 위해서 한꺼번에 많은 샘플을 처리할수 있는 sampling techniques이 필요하다. solid-phase produced compounds는 solid-phase support로부터 분리되어질수도 있고, 적절한 용매에 녹인다음, solution-produced compound 때와 같은 방법으로 분석하면된다. 그러나, polymer-resin으로부터 떼어내지 않고서도 solid-phase compounds들을 분석할수 있도록 하는 방법들이 현재 개발되고 있다. Libraries를 만들기 위해서는 solution-phase 나 solid-phase synthetic procedures가 각 two-step reaction이나 five-step reaction에 따라 다양한 reactant와 함께 도입된다. libraries를 생성하기위해 반응 스텝이 길어질수록, 라이브러리내의 시료수는 더욱 증가한다. 두 개의 반응물 X와 Y가 반응하는 간단한 one-step 반응의 경우, 각각 10가지 다른 반응물을 도입한다면 가능한 combination수는 100이된다 (10 x 10). 만약 두 번째 과정에서 8개의 반응물을 사용한다면, 생성될수 있는 라이브러리의 수는 800개가 된다 (10 x 10 x 8). 라이브러리 중 오직 하나의 관심있는 화합물만 존재하는 경우에는 "discrete libraries"라고 부르고, 여러개가 함께 있는 경우는 "pooled libraries"라고 부른다. 이러기 위해서는 각 반응 스텝마다 최소한 2개이상의 반응물을 첨가함으로써 된다. 만약 3개의 다른 반응물과 또다른 3개의 반응물이 사용된다면, 최종적으로는 9개의 각각 다른 반응물이 생성될 것이다.만약 또다른 3개의 반응물이 이 반응에 첨가된다면, 가능한 최종산물은 27개가 될 것이다. 가능한 반응 생성물의 수는 반응 수 및 첨가된 반응물의 수에 따라 산술적으로 결정된다. 각 반응물들은 생리활성검색을 위해 제출되거나, 재결정 또는 chromatography방법에 의해 정제된다. 대부분의 경우에, 부산물은 거의 생성되지 않으며, 정제과정은 불필요하다. solid-phase chemistry의 경우에, 최종산물은 지지체(beads, crowns, gears etc) 로부터 떨어져 나오게 되고, 말린다음, 생리활성을 보게 된다. 대부분의 libraries는 hit stage의 경우에는, 보통 96-well microtiter plate format에서 제조된다. 많은 회사들이 이런 format의 자동화 기기들을 공급하고 있다. 일단 라이브러리가 만들어지고 난 뒤엔, 분석적인 방법으로 원하는 products가 생성되었는지 여부를 반드시 확인하여야 한다. 라이브러리를 분석하는 방법은 크게 정량분석과 open-access method가 있다. 비록 대부분의 plate들이 96-well format에서 생성되지만, 이 방법들은 많이 자동화될수 있으며, 다양한 라이브러리 포맷으로부터 샘플링할수 있다. 각 well에 있는 샘플들은 그다음에 flow injection analysis 에 의해 각 well 의 mass spectrum을 얻게 되거나, 또는 LC-MS나 GC-MS에 의해 각 well에 존재하는 혼합물들의 spectrum을 구하게 된다. flow-injection analysis는 보통 well 당 1-2분이 소요되는 반면, LC-MS나 GC-MS는 well당 보통 7-30분이 소요된다. 분석은 각 well 에 존재하는 예상물질의 분자량을 조사하는 것이다. 그런뒤에 table화 하거나 graphic 보고서를 통해 특정 well에서 원하는 화합물이 합성되었는지 여부를 확인한다. 분석동안에 operator가 관여하는 시간은 마치 open-access mass spectrometry처럼 최소한이다. 많은 수의 시료가 생성되기에, 시간과 기기가 분석에 있어서 limiting factor이다. 50000개의 library의 경우에, 각 well의 library를 모두 flow-injection analysis를 할려면 sample analysis time을 1분으로 할 때 최소한 800시간이상 걸린다. 이를 해결하기위해 다음과 같은 두가지 방법이 분석 대상 시료수를 줄이거나 동시에 라이브러리의 integrity를 확실히 하는데 사용된다. 첫째, 초기 라이브러리를 생성할때는 각 libraries members를 자세히 조사한다. chemist들은 작은 수의 library를 가지고 먼저 최적의 조건을 검토한다. 이들 조건을 확립하는 단계인 작은 시료를 가지고 행하는 경우에는 모든 well들을 분석하여 chemist들이 최적의 반응조건을 찾을수 있게 한다. 둘째, 모든 libraries가 완성되었을때는 libraries중에 일부 (5-7%) 만 무작위로 선택하여 mass spectrometry로 분석한다. 만약 원하는 물질이 존재한다고 확인되면, 반응중 error는 일어나지 않았다고 할수 있고, 따라서 나머지 well 에서도 원하는 물질이 존재한다고 생각할수 있다. 물론, 시료의 수가 작을때는, 특히 lead optimization단계에서는 모든 libraries들이 분석되는 것이 좋다. 최종적으로, target enzyme에 대해 "hit"가 일어났다면, 적절한 mass spectrometric techniques을 동원하여 그 hit compound를 확인하고 활성 library의 구조를 분석한다. IV. 약물 대사체 연구에 있어서의 질량분석기술 IV-1. 약물속도론적인 관점 한 화합물이 해당 생리활성 검색에서 "hit"된후에는 target protein에 대한 그물질의 affinity를 최대한 높이는 방향으로 해당 물질의 구조를 구조-활성 상관 관계에 따라 바꾸게 된다. 이들 다양한 화합물들은 in vitro에서 drug candidate가 되기위한 충분한 생리활성을 가지고 있다. "lead" 화합물은 그 다음에 in vivo의 거동을 관찰하게 되고, 특히 이때는 주로 bioavailability나 half-life, therapeutic index 등을 주로 조사하게 된다. Bioavailability는 투여된 약물의 일반적인 체내 순환의 정도를 투여량에 대해 %로 표시한다. half-life는 해당 화합물이 배설이나 대사에 의해 최대혈장농도가 반으로 줄어드는데 걸리는 시간을 의미한다. Therapeutic index는 원하는 therapeutic activity와 원하지 않는 toxic side-effect의 농도사이의 compound의 selectivity를 나타낸다. 임상적인 관점에서, 가장 유망한 약물은 high therapeutic index를 가지고 있고, oral bioavailability 및 biological half-life가 일회 경구투여만으로도 충분한 것이 되겠다. 따라서 lead compound는 반드시 높은 oral availability (>30%) 및 비교적 긴 biological half-life (>4 h)를 가지고 있어야 한다. 이런 파라미터를 결정하는데 필요한 것은 serum이나 plasma에 존재하는 약물의 농도를 정확하고 빠르게 분석할 수 있는 방법이다. 투여후 시간에 따른 약물 농도의 변화를 관측함으로써 해당 화합물의 pharmacokinetics를 결정할 수 있다. 정맥투여나 경구투여후에 pharmacokinetics를 결정함으로써 bioavailability나 half-life를 결정할수 있다. 이들 데이터를 통해 해당 약물의 적절한 농도를 결정하게 되고, 이것은 약물의 혈중 농도가 최소한 minimal effective response는 넘어야하며, 최대한 minimal toxic dose level은 넘지 말아야 한다. 이들 3가지 파라미터를 결정함으로써 medicinal chemist들이 해당 약물의 구조를 더욱 최적화해야하는 지 여부를 결정하게 된다. 최근까지만해도 이러한 파라미터를 결정했던 기기로는 HPLC 와 UV나 fluorescent detector를 사용하였다. Protein precipitation method가 보통 간편하고, recovery도 좋아서 시료 전처리 방법으로 많이 사용되었다. 그러나, 이런 high recovery는 방법의 selectivity를 떨어뜨리므로, 수많은 endogenous components들이 함께 추출되는 결과를 초래하였다. 이들 endogenous components들은 약물을 보통의 방법으로 잘 정량하기위해서는 반드시 해당 약물로부터 크로마토그라피 상에서 잘 분리되어야한다. 아울러, 생성된 metabolites들 역시 크로마토그라피 상에서 분리되어야 할 간섭물질로 작용한다. 각 종에 따라 endogenous components들도 다르고, 따라서 chromatographic method를 revalidate하거나 어떤 경우에는 해당 종에 따라 다시 개발해야하기도 한다. 보통 주어진 짧은 시간내에 해당 종에 대해 분석조건을 확립해야한다. 그러나, 신약개발의 경쟁에서는 이제 이정도의 시간도 더 이상 의미가 없게 되었다. Fred McLafferty 교수는 분석방법은 크게 감도(sensitivity), 선택성(selectivity), 속도(speed) 와 비용($, money) 등의 4가지 요인이 있다고 정의하였다. 이 정의는 신약개발과정에 있어서 확실히 중요하다. 개발된 의약품들의 약효가 강해짐에 따라, 용량은 점차로 줄어들고, 따라서 더욱 낮은 검출한계를 요구하게 된다. 약물들의 pahrmacokinetics를 잘 설명하기 위해서는 그 약물의 half-life의 5배의 시간동안 걸쳐서 보통 약물의 혈중 농도를 정확히 정량할 필요가 있다. 또한 다양한 종에 있어서도 사용될수 있는 분석법이 필요하기에, 분석방법은 높은 선택성(selectivity)을 가져야하며, 이상적으로는 대상물질과 내부표준물질만 검출하면 좋다. 고도의 선택성은 시료분석시간을 1-3 min으로 단축시켜주며, 따라서 분석방법의 선택성은 분석시간에 직접 영향을 미친다. 제약회사들은 보다 빠른 신약개발에 대한 압력으로 인해, 분석에 걸리는 시간(speed)을 더욱 중요시하게 되었다. 더 한층, 선택성(selectivity)는 분석시간 뿐만 아니라 분석방법의 개발에 소요되는 시간에 까지 직접 영향을 미친다. 선택성이 증가함에 따라 분석법 개발에 필요한 시간 또한 줄어든다. project 초기 단계에서는 여러 가지 많은 화합물들이 검색되어야하며, UV detector를 사용한 분석방법을 개발하는데 걸리는 시간은 종종 막상 시료를 정량할 때 걸리는 시간보다 더 걸릴 때가 있다. 분석에 있어서 마지막 "S"는 비용 ($)로서 샘플당 분석 비용을 의미한다. 신약개발시 가장 효율적인 분석 방법이 검토되어야하나, 시장에 유통되는 의약품중 특허권이 있는 전형적인 약물인 경우 보통 신약개발에 소요된 비용을 계상해서 일년에 약 $100,000,000 이상을 벌어들일수 있다. 하지만, 특허기간이 짧은 의약품은 오히려 시장에 빨리 진출시키는 것이 분석비용을 줄이는 것보다 더욱 중요하다. pharmacokinetic information이 보다 빨리 medical chemist들에게 돌아갈수록, 더욱 빨리 구조-활성 상관관계를 최적화할수 있고 약물은 검색단계(discovery)에서 개발단계(development)로 진행되게 된다. IV-2. 약물의 신속한 정량분석을 위한 LC-API/MS/MS의 응용 1986년에 Covey, Lee, Henion 등이 신약개발을 위해 triple quadrupole mass spectrometer를 이용하여 새로운 정량적 분석방법을 소개하였고, 이것은 현재 제약회사의 주요한 분석법으로 자리잡았다. 이 방법이 바로 LC-API/MS/MS (Liquid Chromstography coupled with Tandem mass spectrometry using atmospheric-pressure ionization interfaces)이다. 고도의 선택성을 지고 있는 tandem mass spectrometry는 이전에 생체시료중의 혼합물을 분석하는데 사용되어왔다. Covey와 Henion 방법의 새로운 점은 fast LC column과 atmospheric-pressure chemical ionization (heated nebulizer) interface를 tandem mass spectrometry에 연결한 것이다. fast LC column은 33 mm길이와 3 micrometer의 고정상을 가진 짧은 column이다. 또한 일반적인 250 mm column 보다 33mm column을 사용하면 small particle에 의한 mobile phase의 back pressure를 줄일뿐만 아니라 분석물질간의 분리도(resolution)도 아울러 줄어들면서 분석시간을 7.5배 단축시켜준다. 이러한 분리도(resolution)의 감소는 더욱 작은 particle을 사용함으로써 분리효율을 증가시킴으로 인해 어느정도 차감할수 있다. 생체시료나 조직중의 약물의 정량하기 위해서 이와 같은 fast LC-column이 사용가능한 이유는 바로 tandem mass spectrometry의 높은 선택성과 감도 때문이다. Q1과 Q3에서 단위 mass resolution으로 mutiple reaction monitoring mode로 triple quadrupole을 사용하는 것은 대부분의 경우 분석대상시료 및 내부표준물질 외에는 시료중 어떤 다른 물질도 거의 검출되지 않는다. 아울러 noise의 감소로 인한 높은 선택성(Selectivity)으로 아주 좋은 S/N ratio를 가지게 되며 따라서 분석대상에 대해 아주 낮은 검출한계 (limit of detection)을 가지게 된다. 게다가 선택성이 좋기에 시료 전처리과정에서 단백질 침전에 의한 시료 전처리같은 간단한 전처리로도 분석가능하며, LC는 analyte를 salts가 용출되는 시간대인 void colume이상을 유지할수 있을 정도의 분리도의 column이면 충분하다. 따라서 이와 같이 high-throughput protein precipitation 방법에 의해 시료 전처리 시간을 크게 줄일수 있다.시료 전처리 방법을 개발하는데 걸리는 시간이 거의 "0"에 가깝기 때문에 전체적으로 몇주 또는 몇 달이 걸리던 분석방법개발에 필요한 시간이 하루면 충분하게 되었다. 분석방법개발에 걸리는 시간을 놀라울정도로 단축시킨 것 이것이 바로 LC-MS/MS를 이용한 정량의 아주 중요한 장점이다. Atmopheric-pressure ionization interfaces (APCI or electrospray)는 tandem mass spectrometry와 연결하기 용이한 이상적인 interafce이다. 둘다 전형적인 [M+H]+ 같은 pseudo-molecular ions을 생성하며, fragmentation은 거의 일어나지 않는다. mass spectrometry의 인터페이스를 선정하는 주요기준으로 종종 용액상에서 analyte들의 proton affinity를 많이 참고한다. electrospray는 용액상에서 preprotonated되거나 deprotonated될수 있는 물질일 경우 용이하고 따라서 확실히 basic (or acidic)한 화합물들이 잘 적용되는 반면, APCI는 보다 중성적인(neu되어 있기는 하다). APCI와 electrospray interface의 중요한 차이점으로는 electrospray는 농도-의존적인 (concentration-dependent) 검출인 반면에 APCI는 mass-flux-sensitive한 검출기라는 점이다. electrospray의 농도의존적인 반응으로 인해 작은 직경의 HPLC co되어 있기는 하다). APCI와 electrospray interface의 중요한 차이점으로는 electrospray는 농도-의존적인 (concentration-dependent) 검출인 반면에 APCI는 mass-flux-sensitive한 검출기라는 점이다. electrospray의 농도의존적인 반응으로 인해 작은 직경의 HPLC co되어 있기는 하다). V. 결 론 지난 십수년간 mass spectrometry에 있어서 혁명적인 변화, 특히 ESI, APCI, MALDI 등과 같이 광범위하게 사용될수 있는 이온화기법의 도입은 mass spectrometry를 모든 신약개발과정에서 필수적인 tool로 자리매김하게 하였다. 이과정의 첫 번째 단계로, 질병의 병인에 관여하는 단백질을 동정하는 일등은 더욱 가속화되고 있고, 특히 아주 큰 분자량의 가진 화합물의 미세한 구조변화도 정확히 검출해 내는 방향으로 중점을 맞추고 있다. 이러한 앞선 mass spectrometry instrumentation의 영향으로, 보다 사용하기 쉽고 자동화된 방법들이 개발되어 lead compound의 selection과 optimization에 대해 빠른 결과를 보이고 있고, medicinal chemistry나 cobmbinatorial chemistry에 의해 만들어진 'hit' compound의 확인에 까지 응용되고 있다. 마지막으로 lead compound의 in vivo pharmacokinetic activity를 최적화하는데 가장 강력한 도구가 되었다. 이와같은 mass spectrometry는 빠른 발전 및 다재다능한 기능을 통해 이제는 신약개발에 있어서 없어서는 안될 가장 중요한 tool이 되었고, 이러한 경향은 신약개발에 대한 압력이 커질수록 더욱 커질 전망이다.