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[실험경험에 의한 답변] Rat에서 분리한 PLA2를 가지고 실험했던 저희방 선배분이 세미나때발표하길 기질을 잘만들어야 한다고했습니다. 세포막을 Ca2+하에서 인공적으로 sonication시켜 liposome상태를 유도하는것이 key입니다. 그냥 박테리아를 증류수로 washing하여서는 enzyme activity가 잘 관찰안될겁니다. 그래서 보통 radio isotope를 이용하여 activity를 관찰합니다. [문헌에의한 답변] J Clin Invest, March 1999, Volume 103, Number 5, 715-721 보면 방법부분에. Assay of bacterial phospholipid degradation. Because phospholipid breakdown products formed during PLA2 treatment are quantitatively recovered in the extracellular medium complexed to albumin, whereas undigested phospholipid remains within the bacterial envelope, phospholipid degradation was routinely measured as accumulation of radioactive material in the supernatant recovered after sedimentation of the bacteria (11,000 g for 4 min). To confirm that release corresponded quantitatively to phospholipid degradation, the lipids of S. aureus, with and without PLA2 treatment, were extracted using the method of Bligh and Dyer (14) and resolved as described previously (6). Phospholipid degradation of the control samples (no PLA2) was 5%. (14)Bligh, E.S., and Dyer, W.J. 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917. (6)Weinrauch, Y., Elsbach, P., Madsen, L.M., Foreman, A., and Weiss, J. 1996. The potent anti–Staphylococcus aureus activity of a sterile rabbit inflammatory fluid is due to a 14-kD phospholipase A2. J. Clin. Invest. 97:250-257. 라고 나와있군요. [직관에 의한 답변] 어떤 실험인지 모르겠으나 디자인에 문제가 있는듯합니다. 아무리 PLA2활성이 좋아도 그 양은 매우 적습니다. carboxyl group을 측정하는데 방사선동위원소나 다른 민감한 방법을 강구해야 할듯합니다. 단순히 carboxyl group이 떨어지는것을 관찰하기는 쉽지 않을듯합니다. >phospholipase A2를 이용하여 세포막의 ester 결합을 끊고 carboxyl group을 생성시키는 즉, phospholipid를 hydrolysis 시키는 실험을 수행하였습니다. >enzyme에 관해서는 문외한 인지라 처음에는 최적 pH, 최적 온도, cofactor등이 필요한지도 모르고 그냥 섞어보았다가 원하는 결과가 나오지 않기도 했습니다. (여기서 원하는 결과란 phospholipid의 hydrolysis로 인하여 세포막에 carboxyl group이 증가하는 것을 말합니다.) >하지만 그 모든 것들을 알고, pH는 8, 온도는 40도, cofactor로 10mM의 칼슘을 첨가하고 매우 충분한 시간이라고 생각되는 18시간 동안 교반 시켜보았지만 여전히 carboxyl group은 증가하지 않았더군요. >실험이 원하는 결과가 나오지 않은 이유를 곰곰히 생각해 보았지만 뚜렷한 답이 나오질 않습니다. 구입한 phospholipase A2는 세포막의 ester결합을 매우 강력하게 hydrolyze시킨다고 나와있는데 말이죠. 제가 사용한 박테리아는 그람양성 박테리아 이며, 증류수에서 반응을 시켰기 때문에 별다른 inhibition은 없을 것이라 생각됩니다. >혹시, 이런 생각을 해봅니다. enzyme과의 반응이 끝난 박테리아는 증류수로 washing하는 과정에서 저의 실험 목적상 pH를 낮출 필요가 있어서 질산을 첨가하여 pH를 낮춰주는 과정에 들어갑니다. 이때 enzyme에 의해 떨어졌던 glycerol part가 다시 결합하여 ester결합을 형성하는 것은 아닐까 생각해봅니다. SN 1 반응이 일어나듯이 glycerol 부분에 생성된 OH기에 pH가 낮아지면서 H+가 붙으면서 OH는 떨어져 나가고 그 자리엔 carbocation이 생성되고....그 자리에 아까 생성되었던 carboxyl group의 OH부분이 붙으면서 ester결합이 생성되는것 아닌가 하는 생각을 해봅니다. >학부때 배웠던 짧은 유기화학과 생화학 지식으로 생각하려니 한계에 부딛치는듯 합니다. 부디 고수님들이 의견을 주시길 바랍니다. 제 생각이 맞는 것인지, 그렇다면 어떻게 해야 할지.....>